一般而言，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋， 無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。羅氏480定量PCR儀代理下面做簡(jiǎn)單介紹：

 

1、熒光域值（threshold）

 

   是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。

 

2、Ct 值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

 

 

3、Ct值與起始模板的關(guān)系：

 

   研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中橫坐 標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。